近年来，免疫疗法作为一种新的癌症治疗方式引起研究者的广泛关注。在新近开发的癌症免疫治疗技术中，嵌合抗原受体修饰的T细胞（CAR-T）技术备受青睐。从1989年第一代CAR-T开发至今，基于CAR-T的癌症免疫治疗取得了重大进展。数十项CAR-T临床试验正在全球范围内进行（图1）。为了构建CAR-T，向T细胞内导入编码识别癌症抗原单链Fv（scFv）的融合蛋白基因，与T细胞受体的细胞内信号传导结构域相连。

根据T细胞受体的细胞内信号传导域数目，CAR-Ts分为第一代，第二代和第三代（图2）。第一代CAR-T细胞被设计为在细胞外表达scFv，并且T细胞受体胞内信号结构域没有共刺激分子表达。但第一代CAR-Ts通过特异性抗原识别肿瘤细胞后，其对肿瘤细胞的杀伤力不足。为了克服这些缺陷，第二代和第三代CAR-Ts被设计为在细胞内表达共刺激分子（图2）。第二代CAR-Ts的嵌合抗原受体（CAR）基因框架包含一种共刺激分子，如CD28或4-1BB。第三代CAR-Ts进一步发展为包括CD27，CD28，4-1BB和OX40在内的两种共刺激分子。

CAR-T的制备和给药

CAR-Ts通过三个连续步骤制备（Lee et al.2012； Wang and Riviere 2015； Levine 2015）。第一步是构建CAR的基因框架，用于编码与T细胞受体的信号序列连接的肿瘤抗原特异性Fv。第二步，用病毒、非病毒或物理方法将CAR导入T细胞。逆转录病毒或慢病毒是成功应用于CAR导入T细胞的病毒载体。也有研究通过电穿孔将编码CAR的质粒DNA或RNA导入T细胞。第三步是培养CAR-T细胞。

有几种方法试图激活T细胞以利于转染，其中之一是使用抗CD3抗体和细胞因子，如白细胞介素2。其他T细胞激活方法正在研究阶段（图3）。表达4-1BBL和Fc受体的抗原呈递细胞也被用于激活T细胞。另一种方法使用经抗CD3和抗CD28抗体修饰的珠子进行T细胞活化。CAR-T细胞来源于CD4或CD8 T细胞，使用细胞因子扩增，并通过静脉回输给患者。

CAR-T对比现有免疫疗法治疗癌症的优势

CAR-Ts相较于单克隆抗体和抗体-药物联合用药，其对抗终末期癌症的有效性引起研究者的广泛关注。另外，CAR-Ts作用机制与T细胞受体工程T细胞（TCR-T）不同。TCR-T中，TCR识别在APC细胞中加工并与MHC分子共同表达于APC细胞表面的肿瘤抗原复合物。与TCR-T不同，CAR-Ts对肿瘤抗原识别不需要对抗原进行加工和表达，不需要用MHC分子参与（；图4）。表1总结了CAR-T和TCR-T之间的差异。值得注意的是，缺乏MHC限制意味着适用CAR-T的患者比TCR-T更广，TCR-T治疗需要鉴定患者的MHC类型。

CAR-T研究现状

CAR-T已经应用于治疗淋巴癌和实体肿瘤的多个研究中，涵盖细胞水平（表2；图5）、动物水平（表2；图5）、临床前（表3；图5）和临床研究（表4；图6）。CAR-T基础研究阶段状况显示，在CAR基因导入T细胞时应用逆转录病毒载体的最为广泛。虽然病毒载体的使用占据主导，但阳离子聚合物或电穿孔等非病毒转染方法已经尝试过（图5a）。淋巴癌等血癌已成为CAR-T基础研究阶段的主要治疗目标（图5b）。第二代CAR-Ts已成为基础细胞水平和动物水平研究最广的领域，主要针对血癌和实体肿瘤（图5c）。CAR-T应用已经从癌症免疫治疗扩展到自体免疫疾病治疗，如欧洲的多发性硬化症。另一项最新研究报告指出CAR-T治疗真菌感染的新领域。同本研究相似，临床前研究中，构建第二代CAR和利用逆转录病毒载体的频率均高于其他类型CAR（图5f）和病毒载体（图5d）。值得注意的是，血癌临床前研究低于脑癌（图5e）。

将CAR-T基因导入T细胞，病毒载体占主导地位。报道称体内CAR-T存活时间长达几个月。由于CAR持续表达可引起不良反应，因此最佳表达时长需要进一步研究。为缩短CAR表达持续时间并降低安全隐患，正在进行物理电穿孔转染研究。通过电穿孔导入T细胞细胞质的编码CAR的质粒DNA连续数天表达，可避免转染载体引起的不良反应。

目前，全球有超过80个CAR-T项目正在进行临床研究（www.clinicaltrials.gov）。目前还没有项目进入Ⅲ期临床，但鉴于Ⅱ临床数据（表4），获准可能性很高。CAR-T的大部分临床研究在美国进行，部分在中国和日本开展（图1）。作为CAR-T的肿瘤抗原靶点，CD19被广泛研究，其在急性淋巴细胞性白血病（ALL）患者的白血病细胞表面上超表达。报道称，CD19 CAR-T对骨髓移植后复发性ALL患儿有效（Lee et al.2015）。临床研究的产品中，针对ALL的CTL019（Novartis，美国）、CD19靶向CAR-T（CD19-CAR-T）被美国食品和药物管理局认定为“突破性疗法”，正处于Ⅱ临床阶段。其他几家全球制药公司也开发CAR-T产品。临床研究中，CD19已被广泛用作血液癌症的靶抗原（图6a）。其他靶抗原包括癌胚抗原（CEA）、人表皮生长因子受体2（HER2）、GD2、CD30和CD20（图6a）。血液癌症是临床研究的主要方向（图6b）。目前为止，Ⅱ临床是CAR-Ts研究的最快阶段（图6c）。

挑战

每一代CAR-T的限制

尽管CAR-T利用了T细胞杀伤异常细胞的免疫反应，但对实体肿瘤细胞的杀伤力较弱。其抗肿瘤活性降低归因于肿瘤组织微环境的免疫抑制作用，导致CAR-T对实体瘤的渗透效率降低。而且，肿瘤中的白细胞分泌的细胞因子降低了T细胞活性。

第二代CAR-Ts含有的共刺激信号结构域可诱导免疫抑制受体如T细胞膜蛋白-3、细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4（CTLA-4）和细胞凋亡-1（PD-1）。为了克服PD-1对CAR-T的活性抑制，正在研究抗PD-1抗体与CAR-T联合使用的效果。一项临床研究（NCT00586391）正在探索CAR-T和抗CTLA-4抗体ipilimumab联合使用的效果。

具备两种共刺激分子如OX40和4-1BB的第三代CAR-Ts在体内活性增强。然而，两种共刺激分子对T细胞活性的过度刺激可诱导细胞因子分泌的突然增加，称为“细胞因子释放综合征”（CRS）。这种严重的不良反应是CAR-T开发过程中需要解决的最大安全问题之一。

不良反应

CAR-T临床研究最大的障碍是其严重的不良反应，其中CRS最为严重。接受CAR-T临床试验的患者的死亡率突显临床方案设计改进的和新药开发监管的必要性。CRS的症状包括高热、关节疼痛、肌肉疼痛、低血压和呼吸困难，少数病例死亡。2014年，两名患者接受Juno Therapeutics公司（美国）CD19-CAR-T治疗后两周内死亡，此项在Memorial Sloan Kettering癌症中心进行的临床研究被迫中止。迄今为止，CRS已被确定为临床试验中患者死亡的主要原因。

尽管CRS是CAR-T疗法最常见的不良反应，但CRS的进程也被认为与治疗作用相关。早期研究发现，对CAR-T治疗有反应的患者会发生CRS，而对治疗无反应的患者不发生CRS。CRS的严重程度与接受CAR-T治疗时的肿瘤负荷相关。鉴于CRS在临床监测中的重要性，需要确定能够预测CRS严重程度的标志物。研究发现，重度CRS中干扰素-γ的峰值水平比在轻度CRS中更高。其他研究提出C反应蛋白可作为严重CRS的标志物。然而，CRS的决定性生物标志物仍有待研究。

为尽量减少不良反应，临床方案设计中甄选患者和优化CAR-T剂量至关重要。目前通过抗白介素-6抗体或类固醇药物与CAR-T联合使用以减少CRS，这方面还需要进一步的研究。此外，评估CAR-T是否能诱导自身免疫或移植物排斥宿主等安全性研究也尤为必要。一些研究评估了细胞因子抑制剂或自杀基因与CAR-T联合给药减少CRS的功效。最近的一项研究报道，CAR-T与抗白细胞介素-6抗体tocilizumab联合给药可缓解CRS。

大多数临床研究使用病毒载体转染CAR基因，用于CAR-Ts的构建。尽管这些载体被改造为不可复制的，但应该对其潜在复制能力进行长期（多年）监测。CAR-T给药后对细胞因子的分析和标准化是必要的。2014年两名患者的死亡表明CRS是CAR-T临床研究中最严重的缺陷。CAR-T细胞体内扩增引起细胞因子过度分泌，并且可能导致死亡。为了监测和控制CRS，确定细胞因子的特定作用和相关细胞因子的类型有助于预测临床研究中的CRS风险。此外，临床研究期间细胞因子和CRS标记细胞因子的分析应该标准化。

在CD19-CAR-T案例中，抗癌作用伴有一定程度的不良反应。探索CAR-T疗效与不良反应相分离的可能性，旨在建立CRS最小化的给药方案。CAR-T的自身免疫是另一个潜在的问题。低剂量的CAR-T和单一CAR-T的系列肿瘤细胞杀伤作用可降低自身免疫发生的可能性。然而，CAR-T的人工构建性质可能增加其自身免疫的风险。因此，为确保安全，对自身免疫问题的监管不应忽视。

除了CRS，另一个值得关心的不良反应是“脱靶”。此类不良反应是由于CAR-Ts的大多数靶抗原共同存在于肿瘤和正常组织上，只是在肿瘤细胞过度表达。为将“脱靶”的不良反应降至最低，寻找仅在肿瘤细胞表达的新靶分子是必要的。另一种途径是去除非适当激活的CAR-Ts。最近的一项研究报道，小分子药物AP1903可以在转染的细胞中诱导caspase 9和细胞凋亡，只杀死表达高水平CAR的活化细胞。

监管

美国诺华公司（Novartis）设计的CD19-CAR-T CTL019是第一个进入Ⅱ期临床研究的CAR-T类化合物。从监管角度看，CAR-T制备和临床研究是主要关注的问题。制备问题包括CAR-T产品的一致性、患者依赖的T细胞转染效率、适宜CAR转染的最佳T细胞类型以及CAR-T标记。临床研究主要关注效力和安全性。

CAR-T的药代动力学和生物分布

药代动力学和生物分布实验为预测CAR-T可能存在的不良反应提供了必要信息。最近的一项研究报道，CAR-T经静脉内给药后分布到骨髓，在血液中循环中持续存在10个月以上。进一步定量分析药代动力学、体内组织分布和保留是必不可少的。肿瘤抗原HER-2在脑组织和乳腺中表达；在结肠或正常组织中鉴定出了另一种肿瘤抗原—癌胚抗原；肿瘤抗原在正常组织中的非特异性表达增加了CAR-T对正常组织损伤的可能性。从这些角度看，与CAR-T的分布和药代动力学相关的监管问题有待解决。

CAR-T效力

与CAR-T效力相关的一个关注点是挑选合适的T细胞亚群。临床研究中大多数CAR-Ts是从患者全部T细胞中分离导入CAR基因的T细胞获得。T细胞亚型是否影响CAR-Ts的转染效率和效力还需进一步研究。

CAR-T效力评估方法需进一步探索。目前CAR-Ts的诱导肿瘤细胞溶解和细胞因子分泌能力处在研究阶段。建立评价CAR-T效力的相关方法有助于对CAR-T产品进行标准化评估。此外，由于CAR-T在体内扩增，有必要评估CAR-T占总T细胞的比率、CAR拷贝数和效力之间的相互联系。

不同于化学药物或蛋白质药物，CAR-T是一种活性药物，给药后可在体内扩增。这种扩增导致CAR-T的实际有效剂量增加。症状严重程度和患者年龄可能是影响CAR-T体内扩增效率的因素。给药剂量和实际发生效用剂量之间存在差异是CAR-T的独特特征。进一步分析给药剂量、效用剂量和治疗效果之间的关系是必要的。

需要鉴定出具备抗癌活性的特定T细胞亚型。目前，CAR-T给药是各种T细胞亚群的混合物。 最近的一项研究表明，在动物模型中，增加最接近记忆性T细胞干细胞的CD8（+）CD45RA（+）CCR7（+）的CAR-T比例，抗癌活性增强。

CAR-T的临床研究

几个关于CAR-T最佳剂量的问题需要澄清。由于静脉输注的CAR-T在体内扩增，初始剂量与实际发挥效用的剂量不同。另外，剂量的调整标准应该依据患者的体重和体表面积。考虑到输注后分布至骨髓的CAR-Ts的扩增，我们需要确定测量所得血液中CAR-T数量是否反映骨髓中CAR-T的扩增。

CAR-T产品的制造和质量控制

为了验证CAR-T批间质量一致性，药品制造和控制（CMC）至关重要。对CAR-T生产的每一步实施质量控制十分必要（图7）。通过质量控制，保持CAR转染效率的批间一致性，质控参数包括基因修饰的CAR-T占总T细胞比例的可接受范围和单个细胞CAR基因拷贝数量。为了持续稳定的生产CAR-T，需要提供标准化的转染和增殖稳定的病毒载体。此外，应该评估患者年龄和用药史对CAR转染T细胞的影响。

病毒载体如逆转录病毒载体或慢病毒载体经常用于将CAR导入T细胞。应从纯度、安全性、T细胞转染效率和物理化学特性等方面对转染CAR基因的病毒载体进行质量控制。

此外，质控中CAR-T无菌验证必不可少。由于CAR-T是由离体T细胞制备的，期间经过CAR基因的导入和扩增，需要建立CAR-T的无菌检查和微生物限度。

CAR-T的生产和分配需要标准化。经过理论设计和验证之后，大部分生产工艺从实验室转移到生产车间。携带CAR的病毒载体和CAR-T的制造过程复杂且在开发者之间存在差异。临床研究使用的CAR-T产品经不同的生产和分配方案到达患者。基因修饰细胞的生产和分配过程对质量影响至关重要。制造和分配的质量控制和标准化应以实践为指导。

CAR-T产品的标签应仔细核对。由于CAR-T的自体性质，CAR基因转染患者T细胞并将其回输至同一患者，标识明确对最小化CAR-T在非自体患者体内扩增的潜在致命风险至关重要。

结论

CAR-Ts作为一种新型且有效的癌症免疫疗法吸引了众多研究者的关注。全球制药公司已经开始投资CAR-Ts，有几个产品正在审批中。对CAR-T的监管问题也需关注。具备活性的CAR-T需要严格评估其安全性和有效性。CAR-T的离体制造过程突出了无菌验证和全面产品质量控制的重要性。下一步，严格监管和制定科学的监管指导方针将会加快开发安全有效CAR-T产品的进程，惠及患者。(生物谷Bioon.com）