已有学者基于 Cas13 的反式切割活性开发出了病毒 RNA 检测工具。然而，近期研究表明 Cas13 在真核细胞中的反式切割活性会导致细胞毒性或细胞死亡。

超越RNAi和Cas13：RNA敲低进入Csm时代

由于现有方法的低效和不精确，目前很难在哺乳动物细胞中实现可靠和精准的 RNA 敲低。因此，研究人员致力于开发具有更高特异性和更广泛靶向能力的新型 RNA 敲低工具。CRISPR-Csm 就是其中的一个重要尝试

CRISPR-Csm 来自原核生物的III型 CRISPR 免疫系统，同时具有目标RNA依赖的脱氧核糖核酸酶（DNase）和环寡腺苷酸 （cOA） 合成酶活性。与 RNAi 不同，Csm 可以定位到细胞核，可用于靶向非编码 RNA 和前体 mRNA。与 Cas13 相比，Csm 也具有其特有的优势，因为 Csm 仅在 crRNA 标靶互补区产生顺式切割，而不发生反式切割事件，从而避免了 Cas13 可能导致的细胞毒性或细胞死亡。

在本研究中，Jennifer 等人选择了来自嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）的 Csm 来建立哺乳动物细胞中的 CRISPR-Cas 系统，并尝试对3个细胞核非编码RNA和8个细胞质 mRNA 进行靶向敲低，每个靶点测试三个 crRNA。

结果显示，与非靶向的 crRNA 对照组相比，实验组 crRNA 实现了对全部11个 RNA 靶点的分别敲低，且效率均在90%以上，最高可达99%。这表明 Csm 是一个高度稳定且高效的 RNA 敲低工具，可以对细胞质 RNA 和细胞核 RNA 都实现精确敲低。

crRNA转染后细胞内各靶点RNA的相对丰度

随后，研究人员进行了 RNA 测序，以检查 Csm 介导的敲低在细胞中的潜在脱靶效应。相比于未处理样本， Csm 处理的样本在目标转录本上实现了显著敲低，同时几乎未产生其他差异表达的基因。相比之下，Cas13 处理的样本在实现显著敲低的同时会产生数以千计的差异表达的脱靶基因。另外，RNAi（shRNA）处理的样本虽然差异表达的脱靶基因较少，但是其对细胞核 RNA（例如MALAT1）的敲低效果却欠佳。这表明 Csm 是三种 RNA 敲低方式中的最优选择。

Csm、Cas13或shRNA处理的细胞，与未处理细胞间转录水平的差异比较

为了验证三种敲低方式产生的细胞毒性，研究人员分别用 Csm、Cas13 或 shRNA 构建转染细胞后，使用 WST-1 检测细胞在一段时间内的增殖能力。结果表明，Cas13 处理的细胞，其增殖能力显著下降，而 Csm 或 shRNA 处理的细胞，其增殖能力则不受影响。

Csm、Cas13或shRNA转染后，细胞的相对活力/增殖能力比较

综合本研究的各项实验结果，不难发现 Csm 介导的 RNA 敲低兼具 Cas13 和 shRNA 策略的优点：同时拥有 Cas13 稳健的敲低和细胞核靶向能力，以及 shRNA 的最小的脱靶和细胞毒性。利用 CRISPR-Csm，研究人员在人类细胞中实现了高效的 RNA 敲低 （90%-99%），证实了多蛋白 CRISPR-Cas 效应子复合物作为真核生物RNA靶向工具的可行性和有效性。